【実験操作】

• 1. 2mL容のエッペンチューブに500μLの血漿サンプルを量り取った後、1mLのアセトニトリルを加えた。
• 2. ボルテックスミキサーで約15秒間、振とうし、その後、氷浴中に15分間静置した。
• 3. 遠心分離(1,700×g)後の上澄み液を、エッペンドルフピペットを用いて丁寧に吸い取り、上清を得た。

今回試験に使ったカラムと分析サンプルは“CHIRALPAK® IH” (0.46 cm I.D. x 15 cmL)とワルファリン（構造は下に記載）です。どんなチャレンジをしたか、を簡単に説明しますと、まず上記操作でタンパク除去を行った“除タンパク血漿サンプル”中にワルファリンを溶解させ、150回の連続インジェクション（分析条件も下に記載）を行いました。このときには専用ガードカートリッジは装着せず、またラインフィルターがついていないHPLC装置環境でした。次に、“怠けものが除タンパク処理の手を抜いた”という想定で、上記の“除タンパク血漿サンプル”と“処理をしていない血漿サンプル”を90/10（v/v）の比率で混合し、同じく、ワルファリンを溶解させ同様の条件下、146回の連続インジェクションを行いました。
なお146回という中途半端な回数は、147回目のインジェクション時に、不幸にしてサンプル中の不溶解沈殿物によりサンプルループが目詰まりを起こしたため、このような回数となってしまいました。

早速、試験前と150回連続打ち込み試験後のクロマトグラムとクロマトパラメーター［保持時間(t)、分離係数(α)、分離度(R)、理論段数（N）、ピーク対称性(Ps)およびカラム圧力（Press. Drop）］を右側にお示しします。

t1、R、N1、Ps1およびPress. Dropの推移のグラフもお示しします。各グラフの横軸は打ち込み回数を示しています。

カラム圧は全く変わっていませんね。また分離係数α、ピーク対称性Ps1は、ほぼ変わっていませんが、保持時間t1が140回打ち込みを少し過ぎた頃でごく僅か長くなり、分離度、理論段数もやはり僅かながら高くなりました。この理由は今のところ明瞭にはわかっていませんが、長時間にわたる連続分析中に移動相瓶からごく少量のアセトニトリルが蒸発したことが理由の一つかもしれません。しかし本結果からはしっかりと除タンパクされていたら、カラムパフォ－マンスには悪い影響を及ぼさないことがこれでわかりました。

次に冒頭で書いたように、“除タンパク処理の手を抜いた”　の仮想実験として、“除タンパク血漿サンプル”と“処理をしていない血漿サンプル”を90/10（v/v）で混合した分析サンプルの連続打ち込みを行いました。

同様に、t1、R、N1、Ps1およびPress. Dropの推移のグラフもお示ししました。

結構、興味深い結果が得られましたね。分離係数αは、ほぼ影響がありませんでした。保持時間t1は最初に僅かに短くなり、その後は安定していましたが、やはり140回過ぎた頃、ごくごく僅かに長くなりました。しかし理論段数Nは2割減、カラム圧力Press.は1.5倍増、のように一部のパラメーターに、はっきりと悪影響が見られました。処理なし血漿サンプルを10%混ぜただけでも、やはりカラムはダメージを受けることがわかりました。ちなみに、このカラムに対して通液方向を逆にして一晩、移動相を流してみましたが、カラム圧は上がったままで元には戻りませんでした。
という訳で、尿中にタンパクがおりてはいけないと同じく、HPLC分析サンプル中にもタンパクが混入してはいけないことがこれではっきりしましたね。皆さま、くれぐれもご健康に留意ください。

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